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近年來，隨著多肽藥物在代謝、腫瘤及抗感染等領(lǐng)域的突破，全球多肽藥物市場持續(xù)升溫。在此背景下，多肽合成工藝的效率與質(zhì)量控制變得尤為關(guān)鍵。在多肽合成過程中，氨基是最通用的親核試劑，其?；磻?yīng)是氨基酸偶聯(lián)及肽鏈延伸的基本原理；然而，由于其反應(yīng)活性較高，易在合成過程中發(fā)生多種非預(yù)期的副反應(yīng)，從而嚴(yán)重影響目標(biāo)產(chǎn)物的純度與收率。常見的副反應(yīng)包括：乙?；?、三氟乙?；?、甲?；屯榛取?/span>
1. 肽鏈Nα-乙酰化
肽鏈Nα-乙?；枪滔嚯暮铣桑⊿PPS）中常見的一類副反應(yīng)，會導(dǎo)致肽鏈組裝的意外終止，形成截短的肽雜質(zhì)。除了商品化氨基酸原料中殘留的乙酸等可能引發(fā)乙?；狈磻?yīng)外，人為添加乙酸酐進(jìn)行封端也可能會意外引入雜質(zhì)。
一方面，殘留的乙酸酐在后續(xù)的肽鏈延伸過程中，與游離的Nα反應(yīng)，發(fā)生乙?；狈磻?yīng)，從而終止正在進(jìn)行的肽鏈延伸。另一方面，組氨酸咪唑側(cè)鏈上的保護(hù)基（如對甲苯磺?；┤舭l(fā)生提前脫落，乙酸酐處理可能會使組氨酸側(cè)鏈的咪唑乙?；傻囊阴＿溥蛑虚g體會通過遷移反應(yīng)導(dǎo)致Nα-乙?；?，同樣會終止肽鏈生長。
此外，在加帽封端過程中，可能會伴隨過度乙?；狈磻?yīng)，導(dǎo)致N-乙酰乙酰胺衍生物的形成（圖1）。
圖1 Nα過度乙?；磻?yīng)
2. 三氟乙酰化
三氟乙?；狈磻?yīng)在多肽合成中更為普遍，主要源于三氟乙酸（TFA）與氨基或羥基的反應(yīng)。該反應(yīng)常發(fā)生在肽段從樹脂切割、側(cè)鏈全脫保護(hù)以及Boc固相合成法中反復(fù)脫保護(hù)的步驟中。
如，采用 Boc固相合成法進(jìn)行多肽合成時，反復(fù)用三氟乙酸進(jìn)行脫Boc保護(hù)基，可能導(dǎo)致肽鏈與樹脂之間的酯鍵過早斷裂，形成三氟乙酸酯衍生物，在后續(xù)的堿性環(huán)境中，發(fā)生O→N?；w移，形成三氟乙?；舛说亩屉碾s質(zhì)（圖2）。同樣，在處理絲氨酸、蘇氨酸等含有羥基的氨基酸殘基時，也會經(jīng)歷上述O→N?；w移過程。
圖2 O→N?；w移引發(fā)的三氟乙?；磻?yīng)
氨基甲?；且环N常規(guī)的蛋白質(zhì)修飾策略，目前，源自各種過程的氨基異常甲酰化對多肽合成產(chǎn)生了不良影響。甲酰化副反應(yīng)主要由色氨酸側(cè)鏈保護(hù)基殘留、甲酸試劑引入以及DMF溶劑降解三方面因素引起。
1. 保護(hù)基殘留
在Boc固相合成法中，色氨酸常使用甲?；M(jìn)行側(cè)鏈保護(hù)。在含有賴氨酸的肽鏈中，若脫保護(hù)不完全，殘留的甲?；赡苓w移至賴氨酸側(cè)鏈或肽鏈主鏈氨基上。
2. 試劑引入
在多肽合成中，甲酸常用于Boc脫保護(hù)或作為液相色譜流動相添加劑。在含有色氨酸的肽序列中，使用甲酸脫除Boc保護(hù)時，會導(dǎo)致色氨酸側(cè)鏈上的吲哚發(fā)生甲?；磻?yīng)，生成副產(chǎn)物（圖3）。不過此過程是可逆的，可以在適當(dāng)條件下再生。
圖3 甲酸脫Boc引發(fā)的甲?；狈磻?yīng)
此外，當(dāng)甲酸用作催化劑或洗脫劑時，在特定條件下，也可能引發(fā)不必要的甲酰化副反應(yīng)。
3. 溶劑降解
DMF是甲?；闹饕獊碓粗?，也是多肽合成中常用的有機(jī)溶劑（現(xiàn)已被管控）之一。
一方面，DMF在高溫或強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下可能降解產(chǎn)生甲酸，從而引發(fā)甲?；狈磻?yīng)。
另一方面，DMF在特定條件下會直接參與反應(yīng)，形成相應(yīng)的甲酰胺衍生物。如：在咪唑（或CDI）存在的情況下，氨基酸及其酯可直接與DMF反應(yīng)得到甲酰胺化的產(chǎn)物（圖4）。
圖4 咪唑催化DMF與氨基酸及其酯發(fā)生甲?；磻?yīng)
另外，在多肽合成試劑（如PyBroP）存在下，DMF可能通過類Vilsmeier-Haack反應(yīng)機(jī)制直接導(dǎo)致游離氨基甲?；K止肽鏈延伸（圖5）。同樣，在三氯氧磷等活性酰鹵試劑存在下，DMF也可能會轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的亞胺鎓衍生物，促進(jìn)甲?；磻?yīng)。
圖5 PyBrop/DMF引發(fā)的甲酰化反應(yīng)
N-烷基化是多肽合成中常見的副反應(yīng)之一，一般發(fā)生于肽鏈的Nα以及部分氨基酸側(cè)鏈的官能團(tuán)上，涉及保護(hù)基降解及試劑污染等多種因素。
1. 保護(hù)基裂解引發(fā)的烷基化
肽鏈中Nα-氨基甲酸酯保護(hù)基團(tuán)（如Boc、Fmoc、Z、Alloc）的裂解有可能引發(fā)N-烷基化副反應(yīng)。例如，在Fmoc脫保護(hù)過程中，通常用有機(jī)堿（如哌啶等）來實現(xiàn)，其降解副產(chǎn)物若未及時被堿捕獲并除去，則會與游離的氨基發(fā)生反應(yīng)，生成N-芴甲基化副產(chǎn)物（圖6）。
圖6 Fmoc保護(hù)基脫除過程中的副反應(yīng)
另外，烯丙氧羰基（Alloc）保護(hù)基的脫除通常采用Pd(0)催化。若反應(yīng)體系中缺乏高效的烯丙基清除劑，新游離的氨基可能與中間體π-烯丙基鈀絡(luò)合物發(fā)生反應(yīng)，生成N-烯丙基化副產(chǎn)物（圖7）。
圖7 Alloc保護(hù)基脫除過程中的烯丙基化
2. 甲醛誘導(dǎo)的交聯(lián)與烷基化
甲醛是多肽合成中N-烷基化副反應(yīng)的主要因素之一，其來源通常是在制備過程中產(chǎn)生或者有機(jī)溶劑殘留。甲醛不僅能修飾特定的氨基酸，還能通過亞甲基橋使兩個氨基酸或一個氨基酸內(nèi)的兩個官能團(tuán)交聯(lián)，使產(chǎn)物復(fù)雜化。需注意的是，甲醛介導(dǎo)的亞甲基橋交聯(lián)反應(yīng)需要在高pH環(huán)境下進(jìn)行，一旦 pH 值降低到某個閾值以下，該過程即停止。
多肽合成是一項精細(xì)的系統(tǒng)工程，氨基基團(tuán)的副反應(yīng)貫穿于保護(hù)、偶聯(lián)、切割及純化等多個環(huán)節(jié)。深入理解這些副反應(yīng)的化學(xué)原理，嚴(yán)格控制原料純度，優(yōu)化保護(hù)基策略及工藝參數(shù)，是提升多肽藥物質(zhì)量與收率的關(guān)鍵所在。
蘇州昊帆生物股份有限公司（股票代碼：301393.SZ），成立于2003年，總部位于蘇州市高新區(qū)，是一家為全球醫(yī)藥研發(fā)及生產(chǎn)企業(yè)提供特色原料的國家高新技術(shù)企業(yè)。產(chǎn)品主要應(yīng)用于多肽、核苷酸和醫(yī)藥合成等領(lǐng)域，產(chǎn)品范圍涵蓋特色酰胺鍵構(gòu)成用縮合劑、保護(hù)劑、鏈接劑、抗體偶聯(lián)藥物用蛋白質(zhì)交聯(lián)劑、分子砌塊、脂質(zhì)體、磷試劑等種類。目前已累計研發(fā)生產(chǎn)各類產(chǎn)品達(dá)1500多種。
經(jīng)過二十余年的不懈努力和積累，昊帆生物在全球多肽合成試劑領(lǐng)域持續(xù)深耕，現(xiàn)已發(fā)展成為具有廣泛定制產(chǎn)品覆蓋能力和顯著規(guī)?；a(chǎn)優(yōu)勢的領(lǐng)先企業(yè)，可以滿足各類客戶的特定需求。我們誠摯邀請對該產(chǎn)品感興趣的客戶與我們聯(lián)系，以便進(jìn)一步了解產(chǎn)品詳情，并探討合作機(jī)會。
參考文獻(xiàn)：
[1] Side Reactions in Peptide Synthesis. Yi Yang
